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Leitfaden für Anmelder, 1. Teil: Der Weg zum europäischen Patent

 
 
Beispiel aus dem Gebiet der Chemie
 
Erfindungsbeschreibung 
 
 
Verfahren zur chemischen Synthese von Oligonucleotiden 
Erfindungsbezeichnung (Angabe im Erteilungsantrag genügt) 
 
Gebiet der Erfindung 
 
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur chemischen Synthese von Oligonucleotiden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein neues Verfahren, mit welchem es möglich ist, ein langkettiges DNA- oder RNA-Fragment aus einem an der basischen Funktion ungeschützten Nucleotidphosphoramidit-Baustein leicht und zuverlässig chemisch zu synthetisieren, sowie eine neue Verbindung, welche in diesem Verfahren eingesetzt wird. 
Technisches Gebiet, auf das sich die Erfindung bezieht 
 
Hintergrund der Erfindung 
 
Das Phosphoramidit-Verfahren ist das zurzeit am häufigsten eingesetzte Verfahren für die chemische Synthese von Oligonucleotiden, wie DNA- und RNA-Fragmenten (Nucleic Acids Research, 17: 7059 - 7071, 1989). In der Regel ist der wesentliche Schritt dieses Phosphoramidit-Verfahrens eine Kondensationsreaktion zwischen einem Nucleosidphosphoramidit und einem Nucleosid unter Verwendung von Tetrazol als Aktivator. Da bei dieser Reaktion in der Regel die Hydroxy-Gruppe einer Zuckerfunktion mit der Amino-Gruppe einer Nucleosidbasenfunktion konkurriert, ist es für die Synthese eines gewünschten Nucleotids erforderlich, dass die Reaktion nur selektiv an der Hydroxy-Gruppe einer Zuckerfunktion verläuft. Dementsprechend wurde im Stand der Technik die Nebenreaktion an der Amino-Gruppe dadurch verhindert, dass man die Amino-Gruppe schützte, wie nachfolgendes Reaktionsschema zeigt: 
Angabe des bisherigen Stands der Technik 
 
 
 
Die Schutzgruppe muss jedoch am Ende der Synthese entfernt werden, wobei für das Einfügen und Entfernen dieser Schutzgruppe betriebstechnisch komplizierte organische Reaktionen und große Mengen teurer und schädlicher Reagenzien erforderlich sind, was für die Durchführung dieses Verfahrens des Stands der Technik im Hinblick auf die praktische Anwendbarkeit, die Wirtschaftlichkeit, den Umweltschutz etc. ein großes Problem darstellt. Dementsprechend bestand ein Bedarf nach einem Verfahren für die chemische Synthese eines Oligonucleotids aus einem an der Amino-Gruppe ungeschützten Nucleosidphosphoramidit-Baustein, wobei das im nachfolgenden Reaktionsschema gezeigte Verfahren von Letsinger et al. als bahnbrechend bekannt ist (Nucleic Acids Research, 20: 1879 - 1882, 1992):  
Beurteilung des Stands der Technik 
Das Verfahren von Letsinger et al. ist jedoch nicht praktisch, nicht allgemein anwendbar und wird in der Praxis nicht angewandt, da es folgende Nachteile aufweist:  
(1) Die Kondensationsausbeute ist bei jedem Schritt niedrig (etwa 97 %; für die Synthese eines 50-meren oder längerkettigen Oligonucleotids ist eine Ausbeute von wenigstens 99 % erforderlich); außerdem kann ein kommerzieller DNA-Syntheseautomat bei diesem Verfahren nicht verwendet werden, sodass langkettige Oligonucleotide aus 50 bis 100 Nucleotiden, wie sie in der Regel für die chemische DNA-Synthese etc. erforderlich sind, nicht synthetisiert werden können.  
(2) Es können nur hoch reaktive, spezifische Nucleosidphosphoramidite eingesetzt werden, sodass dieses Verfahren eine nur eingeschränkte Anwendungsbreite hat und nicht praktikabel ist.  
(3) Pyridinhydrochlorid, welches als Aktivator eingesetzt wird, ist eine instabile, gegenüber Feuchtigkeit hoch empfindliche Verbindung, deren Handhabung daher schwierig ist. 
 
Zusammenfassung der Erfindung 
 
Die vorliegende Erfindung wurde vor dem Hintergrund des vorstehend beschriebenen Stands der Technik gemacht, wobei es Aufgabe der vorliegenden Erfindung war, ein praktikables Verfahren bereitzustellen, mit welchem es möglich ist, ein 100-meres oder längerkettiges Oligonucleotid leicht und zuverlässig chemisch zu synthetisieren, sowie eine in diesem Verfahren einzusetzende neue Verbindung bereitzustellen. 
Technische Aufgabe 
 
Die Aufgabe wurde durch ein Verfahren zur chemischen Synthese eines Oligonucleotids nach dem Phosphoramiditverfahren gelöst, bei dem man unter Verwendung eines durch die nachfolgende chemische Formel dargestellten Imidazoltrifluormethansulfonats aus einem an der basischen Funktion ungeschützten Nucleosid ein an der basischen Funktion ungeschütztes Nucleosidphosphoramidit herstellt und das an der basischen Funktion ungeschützte Nucleotidphosphoramidit in einer vorbestimmten Reihenfolge in Gegenwart von Imidazoltrifluormethansulfonat koppelt, um chemisch ein aus einer spezifischen Nucleotidsequenz bestehendes Oligonucleotid zu synthetisieren.  
Offenbarung der Erfindung 
Vorteilhafte Wirkungen der Erfindung 
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das gekoppelte, an der basischen Funktion ungeschützte Nucleosidphosphoramidit mit einer Benzimidazoltrifluormethansulfonatlösung behandelt.  
 
Wir haben gefunden, dass ein an der basischen Funktion ungeschütztes Nucleosidphosphoramidit, welches unter Verwendung der Verbindung Imidazoltrifluormethansulfonat (nachfolgend als Imidazoliumtriflat bezeichnet) anstelle des herkömmlich als Aktivator für die Kondensationsreaktion des Nucleosidphosphoramidits mit dem Nucleotid verwendeten Tetrazols hergestellt wird, keine Nebenreaktionen an der Amino-Gruppe der basischen Funktion des Nucleotids aufweist, sodass komplizierte Verfahrensschritte, wie das Einfügen und Entfernen einer Schutzgruppe, nicht erforderlich sind und außerdem die Synthese in einem kommerziellen Syntheseautomaten durchgeführt werden kann. Des Weiteren haben wir gefunden, dass die Nebenreaktion an der Amino-Gruppe der basischen Funktion vollkommen unterdrückt werden kann, indem man das zuvor beschriebene gekoppelte an der basischen Funktion ungeschützte Nucleosidphosphoramidit mit einer methanolischen Lösung eines Benzimidazoltrifluormethansulfonats (nachfolgend als Benzimidazoliumtriflat bezeichnet) behandelt, wodurch man ein geeigneteres Oligonucleotid erhält. 
Vorteilhafte Wirkungen der Erfindung 
 
Kurze Beschreibung der Zeichnungen 
Kurze Beschreibung der Zeichnungen 
 
Fig. 1 ist eine schematische Darstellung jedes Reaktionsschritts des erfindungsgemäßen Verfahrens.  
Fig. 2 ist eine schematische Darstellung jedes Reaktionsschritts des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem mit Ammoniak behandelt wurde.  
Fig. 3 ist ein HPLC-Chromatogramm von DNA-Fragmenten, die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wurden. 
 
Detaillierte Beschreibung der Erfindung 
 
Nachfolgend wird die beste Ausführungsform der vorliegenden Erfindung detailliert beschrieben.  
Beschreibung eines Wegs zur Ausführung der Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen 
 
Das erfindungsgemäß eingesetzte Imidazoliumtriflat kann dadurch hergestellt werden, dass man Imidazol mit Trifluormethansulfonsäure in einem Verhältnis von 1 : 1 in Dichlormethan mischt, wie es im nachfolgenden Herstellungsbeispiel 1 ausgeführt ist. 
 
Wie Beispiel 1 zeigt, absorbiert das hierbei erhaltene Imidazoliumtriflat keine Feuchtigkeit und ist unter üblichen Anwendungsbedingungen extrem stabil, sodass es leicht gehandhabt werden kann. 
 
Im erfindungsgemäßen chemischen Syntheseverfahren wird unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Imidazoliumtriflats aus einem an der basischen Funktion ungeschützten Nucleotid ein an der basischen Funktion ungeschütztes Nucleosidphosphoramidit hergestellt, wobei das an der basischen Funktion ungeschützte Nucleosidphosphoramidit als Baustein verwendet wird und jedes Nucleosidphosphoramidit in einer vorbestimmten Reihenfolge gekoppelt wird, wodurch ein aus einer spezifischen Nucleotidsequenz bestehendes Oligonucleotid chemisch synthetisiert wird. 
 
Das an der basischen Funktion ungeschützte Nucleosidphosphoramidit kann dadurch hergestellt werden, dass man das an der basischen Funktion ungeschützte Nucleosidphosphoramidit mit Cyanoethylbisamidit in Gegenwart des Imidazoliumtriflats als Katalysator umsetzt, wie dies beispielsweise im nachfolgenden Beispiel 2 dargestellt ist. In diesem Fall verläuft die Reaktion selektiv an der Hydroxy-Gruppe der Zuckerfunktion des Nucleosids, sodass man vier verschiedene N-ungeschützte Nucleosidphosphoramidite, welche bei der DNA-Synthese verwendet werden, nämlich Desoxyadenosin-, Desoxythymidin- Desoxyguanosin- und Thymidinphosphoramidit quantitativ erhalten kann. 
 
Die vier verschiedenen auf diese Weise erhaltenen N-ungeschützten Nucleosidphosphoramidite werden als Bausteine für die Synthese eines Oligonucleotids, welches aus einer gewünschten Nucleotidsequenz besteht, durch Festphasensynthese- oder ähnliche Verfahren, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind, verwendet. Diese Synthese kann außerdem auch in einem herkömmlichen DNA-Syntheseautomaten durch ein Verfahren nach dem entsprechenden Protokoll durchgeführt werden. 
 
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird jedes gekoppelte N-ungeschützte Nucleosidphosphoramidit nach jedem Koppeln vorzugsweise mit einer Benzimidazoliumtriflatlösung (z. B. in einer ethanolischen Lösung) behandelt. Durch diese Behandlung wird die Nebenreaktion an der Amino-Gruppe der basischen Funktion vollständig unterdrückt und somit ein verbessertes Oligonucleotid synthetisiert. 
 
Das Benzimidazoliumtriflat kann gemäß folgendem Reaktionsschema synthetisiert werden: 
 
 
Beispiele 
 
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden nicht einschränkenden Beispiele detailliert beschrieben.  
 
Beispiel 1: Herstellung von Imidazoliumtriflat 
 
Wie nachfolgendes Reaktionsschema zeigt, wurden Imidazol und Trifluormethansulfonsäure in einem Verhältnis von 1 : 1 in Dichlormethan gemischt und 10 Minuten bei 25 °C zum erfindungsgemäßen Imidazoliumtriflat umgesetzt. 
 
Die Analyse des erhaltenen Imidazoliumtriflats nach herkömmlichen Verfahren ergab die in Tabelle 1 aufgeführten Eigenschaften. 
 
Beispiel 2: Herstellung eines an der basischen Funktion ungeschützten Nucleosidphosphoramidits 
 
Das in Beispiel 1 erhaltene Imidazoliumtriflat wurde als Katalysator bei der Umsetzung eines an der basischen Funktion ungeschützten Nucleosids mit Cyanoethylbisamidit verwendet, wie folgendes Reaktionsschema zeigt:  
 
Durch diese Umsetzung wurden die verschiedenen N-ungeschützten Nucleosidphosphoramidite, die in Tabelle 2 aufgeführt sind, nämlich Desoxyadenosin-, Desoxythymidin-, Desoxyguanosin- und Thymidinphosphoramidit, jeweils hergestellt. Wie Tabelle 2 zeigt, wurden die jeweiligen Nucleosidphosphoramidite in beinahe quantitativer Ausbeute erhalten.  
 
Beispiel 3: Synthese eines DNA-Fragments 
 
Aus den 4 verschiedenen in Beispiel 2 erhaltenen N-ungeschützten Nucleosidphosphoramidit-Bausteinen wurde ein 60-meres DNA-Fragment mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 1 durch das Festphasensyntheseverfahren unter Verwendung eines kommerziellen DNA-Syntheseautomaten synthetisiert. Der Reaktionszyklus entsprach der Darstellung in Tabelle 3. 
 
 
Bei dieser Synthesereaktion verlief jeder Schritt (Kondensationsreaktion) der in Tabelle 1 gezeigten Kettenverlängerung mit beinahe 100%-iger Ausbeute, wobei man in der Regel ein an der Phosphatfunktion geschütztes 60-meres Oligonucleotid in einer Ausbeute von 100 % erhielt. Diese Ausbeute ist extrem hoch, wenn man bedenkt, dass die Ausbeute an 60-meren Oligonucleotiden, die über herkömmliche Verfahren hergestellt werden, allgemein etwa 20 bis 40 % beträgt.  
 
Wie Fig. 2 ferner zeigt, erfolgten das Entschützen und die Eliminierung durch Behandlung mit einer Ammoniaklösung (25 °C, 60 Minuten), wobei man die ungeschützte 60-mere DNA in quantitativer Ausbeute erhielt.  
 
Die Analyse der rohen ungeschützten 60-meren DNA durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter den in Tabelle 4 aufgeführten Bedingungen zeigte, dass die Reinheit wenigstens 95 % betrug, wie Fig. 3 zeigt. 
 
Wie vorstehend detailliert beschrieben wurde, weist das Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden unter Verwendung dieses Imidazoliumtriflats folgende Vorteile auf:  
 
(1) Die Kondensationsausbeute beträgt in jedem Schritt 100 %; außerdem kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in Syntheseautomaten durchgeführt werden, wobei man lediglich das Programm für die Synthese und die verwendeten Reagenzien ändert, sodass die Synthese von langkettigen Oligonucleotiden, die aus 50 bis 100 Nucleotiden bestehen, wie sie für die chemische Synthese von DNA etc. normalerweise erforderlich sind, im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren für 1/10 der Kosten oder weniger möglich ist;  
(2) weil unspezifische Nucleotidphosphoramidite eingesetzt werden können, ist das erfindungsgemäße Verfahren breit anwendbar und praktisch; und  
(3) das als Aktivator erfindungsgemäß verwendete Imidazoliumtriflat ist eine stabile Verbindung, welche keine Feuchtigkeit absorbiert, sodass ihre Handhabung unter üblichen Anwendungsbedingungen sehr leicht ist. 
SEQUENZPROTOKOLL 
SEQ ID NO: 1 
Länge: 60 Basen
Typ: Nucleinsäure
Strängigkeit: Einzelstrang
Topologie: Linear 
Molekültyp: synthetische DNA
SEQUENZ: 
 
 
Patentansprüche 
 
1.
Verfahren zur chemischen Synthese eines Oligonucleotids nach dem Phosphoramidit-Verfahren, bei dem man unter Verwendung eines durch die nachstehende chemische Formel dargestellten Imidazoltrifluormethansulfonats aus einem an der basischen Funktion ungeschützten Nucleosid ein an der basischen Funktion ungeschütztes Nucleosidphosphoramidit herstellt und dieses an der basischen Funktion ungeschützte Nucleotidphosphoramidit in einer vorbestimmten Reihenfolge in Gegenwart von Imidazoltrifluormethansulfonat koppelt, um chemisch ein aus einer spezifischen Nucleotidsequenz bestehendes Oligonucleotid zu synthetisieren. 
Unabhängiger Anspruch 
 
 
 
2.
Verfahren nach Anspruch 1 bei dem man das gekoppelte, an der basischen Funktion ungeschützte Nucleosidphosphoramidit mit einer Benzimidazoltrifluormethansulfonatlösung behandelt. 
Abhängiger Anspruch 
 
 
Zusammenfassung 
 
Verfahren zur chemischen Synthese von Oligonucleotiden 
Erfindungsbezeichnung 
 
 
 
Durch die vorliegende Erfindung werden ein praktikables Verfahren, mit welchem es möglich ist, ein 100-meres oder längerkettiges Oligonucleotid leicht und zuverlässig chemisch zu synthetisieren, sowie eine in diesem Verfahren eingesetzte neue Verbindung bereitgestellt. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur chemischen Synthese eines Oligonucleotids nach dem Phosphoramiditverfahren, bei dem man unter Verwendung eines durch die nachfolgende chemische Formel dargestellten Imidazoltrifluormethansulfonats aus einem an der basischen Funktion ungeschützten Nucleosid ein an der basischen Funktion ungeschütztes Nucleosidphosphoramidit herstellt und das an der basischen Funktion ungeschützte Nucleotidphosphoramidit in einer vorbestimmten Reihenfolge koppelt, um chemisch ein aus einer spezifischen Nucleotidsequenz bestehendes Oligonucleotid zu synthetisieren. Sie betrifft ferner ein Imidazoltrifluormethansulfonat mit der folgenden Formel: 
Inhalt der Zusammenfassung