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Guide du déposant, 1e partie: Comment obtenir un brevet européen

 
 
Exemple du domaine de la chimie
Description de l'invention 
 
 
 
Procédé pour la synthèse chimique d'oligonucléotides 
Titre de l'invention (l'indication dans la requête en délivrance suffit) 
 
Domaine de l'invention 
 
La présente invention concerne un procédé de synthèse chimique d'oligonucléotides. En particulier, la présente invention concerne un nouveau procédé capable de synthétiser par voie chimique un fragment d'ADN ou d'ARN à chaîne longue, facilement et de façon fiable, à partir d'un phosphoramidite de nucléotide à base non protégée en tant qu'unité, ainsi qu'un nouveau composé utilisé dans ledit nouveau procédé. 
Domaine technique auquel se rapporte l'invention 
 
Contexte de l'invention 
 
Le procédé au phosphoramidite est utilisé à l'heure actuelle principalement comme procédé de synthèse chimique d'oligonucléotides tels que des fragments d'ADN et des fragments d'ARN (Nucleic Acids Research, 17 : 7059-7071, 1989). En général, ce procédé au phosphoramidite fait appel à une réaction de condensation entre un phosphoramidite de nucléoside et un nucléoside comme réaction clé, au moyen de tétrazole comme accélérateur. Etant donné que cette réaction se fait, habituellement de façon compétitive à la fois sur le groupe hydroxyle d'un groupement sucre et sur le groupe amino d'un groupement basique du nucléoside, il faut que se fasse la réaction sélective seulement sur le groupe hydroxyle d'un groupement sucre pour synthétiser un nucléotide souhaité. Par conséquent, on a empêché dans l'art antérieur la réaction secondaire sur le groupe amino en protégeant le groupe amino, comme le montre le schéma réactionnel suivant : 
Etat de la technique pertinent 
 
 
Cependant, le groupe protecteur doit être éliminé une fois la synthèse terminée, et il faut des réactions organiques compliquées à mettre en œuvre et une grande quantité de réactifs coûteux et nocifs pour introduire et éliminer ledit groupe protecteur, ce qui, si l'on considère l'utilité pratique, l'efficacité économique, la protection de l'environnement, etc., pose un grand problème dans la réalisation de ce procédé antérieur. Par conséquent, il existe une demande pour un procédé de synthèse chimique d'un oligonucléotide à partir d'un phosphoramidite de nucléoside à groupe amino non protégé en tant qu'unité, et le procédé de Letsinger et al., indiqué dans le schéma réactionnel suivant, est connu comme étant un procédé de pointe (Nucleic Acids Research, 20 : 1879–1882, 1992) : 
Appréciation de l'état de la technique 
Toutefois, le procédé de Letsinger et al. n'est ni pratique, ni universel et n'est pas utilisé en pratique car il présente les inconvénients suivants : 
 
(1) le rendement de la condensation dans chaque étape est faible (environ 97 % : il est nécessaire d'avoir un rendement d'au moins 99 % pour la synthèse d'un 50-mère ou d'un oligonucléotide à chaîne plus longue) et on ne peut pas utiliser pour ce procédé un synthétiseur d'ADN automatique du commerce, ce qui fait que l'on ne peut pas synthétiser un oligonucléotide à chaîne longue constitué de 50 à 100 nucléotides, généralement nécessaire dans la synthèse chimique de l'ADN, etc. ; 
(2) on ne peut utiliser que des phosphoramidites de nucléoside spécifiques, fortement réactifs, ce qui fait que ce procédé a une portée d'application limitée et n'est pas pratique ; et 
(3) le chlorhydrate de pyridine utilisé comme accélérateur est un composé instable exigeant une très bonne protection contre l'humidité, et son maniement est donc difficile. 
 
Résumé de l'invention 
 
La présente invention a été réalisée par rapport à l'art antérieur décrit ci-dessus, et le but de la présente invention est d'obtenir un procédé pratique capable de synthétiser par voie chimique un 100-mère ou un oligonucléotide à chaîne plus longue, de façon facile et fiable, ainsi qu'un nouveau composé utilisé dans ledit procédé. 
Problème technique 
 
Pour résoudre le problème, la présente invention fournit un procédé de synthèse chimique d'un oligonucléotide par le procédé au phosphoramidite, ce procédé comprenant la préparation d'un phosphoramidite de nucléoside à base non protégée à partir d'un nucléoside à base non protégée qui fait appel à un imidazole trifluorométhanesulfonate représenté par la formule chimique suivante, et le couplage dudit phosphoramidite de nucléotide à base non protégée dans un ordre prédéterminé, en présence dudit imidazole trifluorométhanesulfonate, pour synthétiser chimiquement un oligonucléotide constitué d'une séquence nucléotidique spécifique. 
Exposé de l'invention 
Avantages apportés par l'invention 
 
 
 
Dans un mode de réalisation préférable du procédé décrit par cette invention, le phosphoramidite de nucléoside à base non protégée couplé est traité avec une solution de benzimidazole trifluorométhanesulfonate. 
 
Autrement dit, les présents inventeurs ont constaté qu'un phosphoramidite de nucléoside à base non protégée préparé grâce à l'emploi du composé qu'est l'imidazole trifluorométhanesulfonate (appelé dans la suite triflate d'imidazolium) à la place du tétrazole utilisé de façon conventionnelle comme accélérateur pour la réaction de condensation entre le phosphoramidite de nucléoside et le nucléotide ne présente pas la réaction secondaire sur le groupe amino dans son groupement basique nucléotidique, et de ce fait ils ont constaté que les procédures compliquées telles que, par exemple, l'introduction et l'élimination d'un groupe protecteur n'étaient pas nécessaires, et aussi que l'on pouvait réaliser sa synthèse au moyen d'un synthétiseur du commerce, ce qui leur a permis d'aboutir à la présente invention. Par ailleurs, les présents inventeurs ont constaté que la réaction secondaire sur le groupe amino dans le groupement basique pouvait être complètement inhibée si l'on traitait le phosphoramidite de nucléoside à base non protégée, couplé, décrit ci-dessus avec une solution méthanolique d'un benzimidazole trifluorométhanesulfonate (appelé dans la suite triflate de benzimidazolium), ce qui permettait de synthétiser un oligonucléotide plus parfait, et cela a permis d'aboutir à la présente invention. 
Avantages apportés par l'invention 
 
Brève description des dessins 
Brève description des dessins 
 
La figure 1 est un schéma de chaque étape réactionnelle du procédé de cette invention. 
La figure 2 est un schéma de chaque étape réactionnelle du procédé de la présente invention où un traitement à l'ammoniac est réalisé. 
La figure 3 est un diagramme de HPLC de fragments d'ADN synthétisés par le procédé de cette invention. 
Description détaillée de l'invention 
 
On décrit en détail dans la suite le meilleur mode de réalisation de la présente invention. 
Description d'au moins un mode de réalisation de l'invention avec référence aux dessins 
 
Le triflate d'imidazolium de la présente invention peut être préparé par mélange d'imidazole avec de l'acide trifluorométhanesulfonique, dans un rapport d'équivalents de 1:1, dans du dichlorométhane, comme l'illustre ci-dessous son exemple de préparation dans l'exemple 1. 
 
Le triflate d'imidazolium ainsi obtenu n'absorbe pas l'humidité comme le montre aussi l'exemple 1 et est extrêmement stable dans les conditions d'emploi habituelles, ce qui fait qu'il peut être facilement manipulé. 
Dans le procédé de synthèse chimique de cette invention, on prépare un phosphoramidite de nucléoside à base non protégée à partir d'un nucléotide à base non protégée, en utilisant le triflate d'imidazolium décrit ci-dessus, et ce phosphoramidite de nucléoside à base non protégée est utilisé comme unité et chaque phosphoramidite de nucléoside est couplé dans un ordre prédéterminé afin de synthétiser chimiquement un oligonucléotide constitué d'une séquence nucléotidique spécifique. 
 
Le phosphoramidite de nucléoside à base non protégée peut être préparé par réaction du phosphoramidite de nucléoside à base non protégée avec du bisamidite de cyanoéthyle, en présence du triflate d'imidazolium comme catalyseur, comme le montre, par exemple, l'exemple 2 ci-dessous. Dans ce cas, la réaction se fait sélectivement sur le groupe hydroxyde du groupement sucre du nucléoside, ce qui fait que l'on peut obtenir quantitativement quatre types de phosphoramidites de nucléoside à groupement N non protégé employés dans la synthèse de l'ADN, à savoir les phosphoramidites de désoxyadénosine, de désoxythymidine, de désoxyguanosine et de thymidine. 
 
Les quatre types de phosphoramidites de nucléoside à groupement N non protégé ainsi obtenus sont utilisés comme unités pour synthétiser un oligonucléotide constitué d'une séquence nucléotidique souhaitée par le procédé de synthèse en phase solide, etc., connu dans la technique. Par ailleurs, cette réaction de synthèse peut aussi être réalisée dans un synthétiseur d'ADN du commerce par un procédé conforme à son mode opératoire. 
 
Dans le procédé de cette invention, chaque phosphoramidite de nucléoside, à groupement N non protégé, couplé est de préférence soumis, après chaque couplage, à un traitement avec une solution (par exemple une solution éthanolique) de triflate de benzimidazolium. Grâce à ce traitement, la réaction secondaire sur le groupe amino du groupement basique est complètement inhibée, et on synthétise ainsi un oligonucléotide plus parfait. 
Le triflate de benzimidazolium peut être synthétisé selon le schéma réactionnel suivant: 
 
 
Exemples 
 
Exemples 
 
Dans la suite, la présente invention est décrite plus en détail et plus spécifiquement à l'aide des exemples, lesquels n'entendent toutefois pas limiter la présente invention. 
 
Exemple 1 : Préparation du triflate d'imidazolium 
On mélange, dans un rapport d'équivalents de 1:1, de l'imidazole et de l'acide trifluorométhanesulfonique dans du dichlorométhane, et on fait réagir à 25°C pendant 10 minutes, comme le montre le schéma réactionnel ci-dessous, ce qui permet de préparer le triflate d'imidazolium de cette invention. 
 
D'après une analyse par des procédés classiques, le triflate d'imidazolium ainsi obtenu a les caractéristiques suivantes indiquées dans le tableau 1. 
 
Exemple 2 : Préparation du phosphoramidite de nucléoside à base non protégée 
On utilise le triflate d'imidazolium obtenu dans l'exemple 1 comme catalyseur pour faire réagir un nucléoside à base non protégée avec du bisamidite de cyanoéthyle, comme le montre le schéma réactionnel suivant : 
 
 
Par cette réaction, on prépare respectivement les quatre types de phosphoramidites de nucléoside à groupement N non protégé indiqués dans le tableau 2, à savoir les phosphoramidites de desoxyadénosine, de désoxythymidine, de désoxyguanosine et de thymidine. Le tableau 2 indique aussi que les phosphoramidites de nucléoside respectifs s'obtiennent de façon presque quantitative. 
 
Exemple 3 : Synthèse d'un fragment d'ADN 
 
A partir des 4 types de phosphoramidites de nucléoside à groupement N non protégé en tant qu'unités, obtenus dans l'exemple 2, on synthétise un fragment d'ADN 60-mère constitué de la séquence nucléotidique de SEQ. ID. NO.: 1 par le procédé de synthèse en phase solide au moyen d'un synthétiseur d'ADN du commerce. Le cycle de réaction est tel qu'indiqué dans le tableau 3. 
 
 
Dans cette réaction de synthèse, chaque étape (réaction de condensation) dans l'allongement de la chaîne indique dans le tableau 1 se fait avec un rendement de presque 100 %, et on obtient un oligonucléotide 60-mère à groupement phosphate protégé habituellement avec un rendement de 100 %. Ce rendement est extrêmement élevé si l'on considère que le rendement d'un oligonucléotide 60-mère par les procédés classiques réalisés généralement est d'environ 20 à 40 %. 
Par ailleurs, comme le montre la figure 2, on réalise la déprotection et l'élimination par traitement avec une solution d'ammoniaque (25°C, 60 minutes), ce qui permet d'obtenir l'ADN 60-mère non protégé avec un rendement quantitatif. 
L'analyse par chromatographie liquide haute performance de 1'ADN 60- mère non protégé brut ainsi obtenu dans les conditions indiquées dans le tableau 4 indique que sa pureté est de 95% ou plus, comme le montre la figure 3. 
 
Comme on l'a décrit en détail ci-dessus, le procédé de synthèse des oligonucléotides grâce au triflate d'imidazolium a les avantages suivants : 
 
(1) le rendement de condensation dans chaque étape atteint 100% et le présent procédé peut aussi être appliqué à un synthétiseur automatique, simplement en changeant le programme de synthèse et les réactifs utilisés, ce qui fait que la synthèse d'un oligonucléotide à chaîne longue constitué de 50 a 100 nucléotides, généralement requis dans la synthèse chimique de l'ADN, etc., est faisable, pour le dixième ou moins du coût des procédés classiques ; 
(2) étant donné que l'on peut utiliser des phosphoramidites de nucléotide non spéciaux, le présent procédé a un cadre d'application large et est pratique ; et 
(3) le triflate d'imidazolium de cette invention, utilisé comme accélérateur, est un composé stable qui n'absorbe pas l'humidité, ce qui fait que son maniement dans des conditions d'emploi habituelles est très facile. 
Listage de séquences 
SEQ. ID. NO.: 1 
LONGUEUR: 60 bases 
TYPE : acide nucléique 
NOMBRE DE BRINS : un 
TOPOLOGIE : linéaire 
TYPE MOLECULAIRE : ADN synthétique 
SEQUENCE: 
 
TATGGGCCTT TTGATAGGAT GCTCACCGAG CAAAACCAAG AACAACCAGG AGATTTTATT 60
 
 
 
Revendications 
 
1. 
Procédé de synthèse chimique d'un oligonucléotide par la chimie des phosphoramidites, qui comprend la préparation d'un phosphoramidite de nucléoside à base non protégée a partir d'un nucléoside à base non protégée, par l'utilisation d'un imidazole trifluorométhanesulfonate représenté par la formule chimique suivante ; et le couplage dudit phosphoramidite à bases non protégées dans un ordre prédéterminé en présence d'imidazole trifluorométhanesulfate pour la synthèse chimique d'un oligonucléotide d'une séquence nucléotidique spécifique. 
Revendication indépendante 
 
2. 
Procédé selon la revendication 1, dans lequel le phosphoramidite de nucléoside à base non protégée couplé est traité par une solution de benzimidazole trifluorométhanesulfate. 
Revendication dépendante 
 
Abrégé 
 
Procédé pour la synthèse chimique d'oligonucléotides 
Titre de l'invention 
 
L'invention se rapporte à un procédé pratique permettant la synthèse chimique d'oligonucléotides à chaîne longue de 100 motifs monomères ou plus de façon aisée et en toute sécurité ainsi qu'au nouveau composé utilisé dans ce procédé. La synthèse chimique de l'oligonucléotide utilise la méthode à la phosphoroamidite, qui comprend la préparation d'un nucléoside phosphoroamidite non protégé par un fragment de molécule à partir d'un nucléoside non protégé par un fragment de molécule en utilisant un imidazole trifluorométhanesulfonate représenté par la formule suivante, et couplage de ce nucléotide phosphoroamidite non protégé par un fragment dans un ordre prédéterminé pour la synthèse chimique d'un oligonucléotide constitué de séquences de nucléotide spécifiques, aussi bien que l'imidazole trifluorométhanesulfonate représenté par la formule chimique suivante : 
Contenu de l'abrégé